Dna fingerprinting

by Francesca on 10/03/2010

Ho fatto molta fatica a reperire sul web informazioni relative al c.d. test del DNA (o DNA fingerprinting o genetic fingerprinting), in quanto le notizie presenti sono o troppo superficiali o troppo tecniche o troppo datate. Riporto qui di seguito i risultati della mia ricerca – modificati grazie alle preziose correzioni di Giorgio (vedi commenti), che ringrazio. Spero così di poter aiutare altri utenti del web – con la preghiera di continuare segnalarmi eventuali errori o imprecisioni

dna fingerprinting

Il test del DNA è impiegato in ambito giuridico soprattutto ai fini dell’accertamento di paternità, dell’identificazione personale (eventualmente anche di cadavere) e nell’ambito di indagini dirette ad individuare i colpevoli di reati. In questo testo, ci limiteremo a considerare quest’ultimo ambito.

Per accertare se un individuo possa essere l’autore di un dato reato, si procede a confrontare il suo DNA con quello rinvenuto sulla scena del crimine o sul corpo della vittima, impiegando un procedimento che, per analogia con quello relativo alle impronte digitali, viene chiamato fingerprinting genetico (o DNA fingerprinting) e che consiste nel comparare alcune sezioni di DNA, dette loci, quelle che, non codificando proteine, variano maggiormente da individuo ad individuo.

Infatti, due soggetti, non legati da rapporti di parentela, hanno in comune circa il 99,9% di sequenza di DNA: la comparazione riguarda, pertanto, solo alcune porzioni, in particolare quelle denominate VNTR (variable number tandem repeats) che consistono in sequenze di nucleotidi ripetute in tandem.

Attualmente, in ambito forense, si analizza soprattutto la classe di VNTR nota come STRs (short tandem repeats) o microsatelliti, sequenze di DNA lunghe 2-6 bp e ripetute numerose volte: il numero delle ripetizioni è ciò che varia da individuo ad individuo e che, quindi, consente di distinguere due soggetti diversi. Il fingerprinting genetico si effettuata, quindi, prendendo in considerazione più STRs, da un minimo di 5 ad massimo di 15. In particolare, i marcatori genetici più utilizzati in ambito forense sono gli STRs costituiti da ripetizioni tetranucleotidiche, che creano minori problemi  rispetto all’amplificazione mediante PCR (cfr. infra).

dna

Con estrema semplificazione, premesso che le tecniche impiegate possono essere molto diverse e sono tutte estremamente complesse, si procede nel seguente modo.

Una volta estratto e purificato il DNA, si procede ad amplificare il materiale genetico da esaminare, attraverso un processo noto come reazione polimerasica a catena (PCR), che consente di moltiplicare le regioni di DNA target, in modo da disporre di una quantità di materiale genetico sufficiente a consentire l’esame.

test dna

A questo punto i diversi frammenti di DNA ottenuti sono separati mediante elettroforesi capillare, una tecnica che sfrutta la presenza di cariche negative sui frammenti di DNA, facendoli migrare su un gel, in presenza di un campo elettrico, dal polo negativo (anodo) verso il polo positivo (catodo). In particolare, posto che la velocità è proporzionale alla massa molecolare, i frammenti di DNA di diversa lunghezza sono separati in base alla loro diversa velocità di migrazione. Mediante l’impiego di fluorocromi (molecole in grado di dare fluorescenza), la migrazione delle molecole è registrata da un rilevatore, analizzata e visualizzata in un unico grafico caratterizzato da una successione di picchi di colori diversi, corrispondenti alle emissioni fluorescenti dei vari fluorocromi. L’esito di questo procedimento è un diagramma colorato (un elettroferogramma)

elettroferogramma

L’elettroferogramma rappresenta la base per determinare il profilo genetico dell’individuo. Al riguardo, occorre, infatti, precisare che, prima di procedere al confronto vero e proprio, è necessario elaborare i risultati delle elettroforesi capillari, eliminando eventuali sovrapposizioni tra gli spettri di emissione, e, soprattutto convertendo l’informazione contenuta nei vari picchi (taglia e quantità dei frammenti di DNA) in un linguaggio comune che permetta di confrontare i dati di laboratori diversi: occorre, cioè, procedere alla determinazione del genotipo, dove i picchi colorati sono convertiti in un formato numerico, che indica il numero di ripetizioni in tandem presenti in ogni allele.

La conversione dell’elettroferogramma in profilo genetico è oggi effettuata tramite software, rinvenibili in commercio, ma questi dati dovranno, poi, essere interpretati da operatori esperti in modo da individuare possibili errori causati, ad esempio, da fattori inerenti alla scarsa quantità del DNA esaminato, dal suo degrado o dalla presenza di profili misti (cioè dal fatto che è stata tipizzata una traccia in cui era presente materiale biologico appartenente a due o più soggetti).

Una volta effettuato tale controllo, se due genotipi collimano, allora si ritiene che i DNA corrispondano.

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Tagliabracci (ed.), Introduzione alla genetica forense
21/03/2010 at 12:31 pm

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Giorgio 10/03/2010 at 3:20 pm

Buongiorno,
volevo segnalare alcune inesattezze riportate soprattutto nella parte che descrive tecnicamente quello che si fa in un “test del DNA”.
Probabilmente c’è stata un po’ di confusione tra quello che si faceva in passato e quello che si fa oggi.
Oggi infatti, nell’analisi di STR, non si utilizzano enzimi di restrizione (usati quando si analizzavano VNTR più lunghe con sonde radioattive, metodica usata fino alla prima metà degli anni ’90 e abbandonata progressivamente) ma si amplifica direttamente mediante PCR il DNA genomico estratto. La metodica di PCR permette infatti di amplificare specifiche regioni di DNA senza il bisogno di selezionare in altro modo il target.
Ormai di prassi vengono analizzati 15 loci STR contemporaneamente (i 13 loci che si trovano spesso indicati sono quelli del sistema CODIS americano) più il marcatore di genere (maschio-femmina).
L’immagine inserita non è una corsa di frammenti ma un elettroferogramma di una sequenza di DNA realizzata con metodo Sanger.
Nel caso del confronto con una traccia, il profilo (di fatto una tabella di numeri) del sospetto deve combaciare perfettamente con ciò che è stato rilevato nella traccia. Se traccia è mista o il profilo parziale diventa chiaramente più complicato ma gli alleli rilevati devono essere perfettamente compatibili con quelli del sospetto per avere identificazione.

Francesca 10/03/2010 at 3:48 pm

Grazie mille! Quindi l’elettroferogramma realizzato con medoto Sanger è diverso da quello che ho descritto…se passa di nuovo di qui, sarebbe così gentile da spiegarmi, brevemente, come funziona?

Francesca 10/03/2010 at 4:14 pm

soprattutto il mio dubbio è il seguente: non si procede ad elettroforesi capillare, ma, dopo la PCR, si applica il sequenziamento con metodo Sanger o della terminazione della catena – oppure, come mi pare di evincere da wikipedia, la sequenza è: PCR, Sanger, separazione dei frammenti?

Ivo Silvestro 14/03/2010 at 2:02 pm

Molto interessante, anche se – lo confesso – mi sono perso in alcuni passaggi evidentemente troppo tecnici.
Una curiosità sugli aspetti legali: mi pare (ma non ho mai approfondito la faccenda) che in diversi ordinamenti il dna fingerprinting abbia valore solo “in negativo”; in poche parole, basta un responso negativo per scagionare un sospettato, ma da solo non sia sufficiente a condannare una persona.

Giorgio 15/03/2010 at 8:44 am

Buongiorno,
il metodo Sanger (di cui è mostrato un elettroferogramma in figura) è una metodica di sequenziamento del DNA, consente cioè di leggere “lettera per lettera” quello che è scritto nel DNA di un individuo. Tenete presente però che il dna di ciascuno di noi è composto da una successione di miliardi di queste lettere e con una sequenza sanger se ne possono leggere al massimo un migliaio per volta. Quello che si fa nel test del DNA è una cosa diversa (dato che tuttora è improponibile “leggere” tutto il dna di una persona), si va a vedere la lunghezza (non la sequenza) di alcuni parti del dna che appunto variano in lunghezza da individo a individuo. Si fa quindi una corsa di frammenti non una sequenza (sebbene entrambe utilizzino l’elettroforesi). La successione quindi è: estrazione DNA, PCR, elettroforesi (corsa di frammenti). Nel caso di compatibilità traccia – sospetto la probabilità che sia casuale, utilizzando 15 loci, è dell’ordine di una su 100-400 miliardi. Il suo elevato valore probante l’ha ormai resa prova principe sia “in positivo” che “in negativo” in ormai tutti gli ordinamenti. Casomai il difficile è dimostrare non che quella traccia appartenga ad un sospetto (il dna ce lo può dire con elevato grado di certezza) ma che il colpevole abbia lasciato quella traccia (cioè collegare una traccia con l’autore del fatto criminoso, potrebbe averla lasciata il sospetto in altro modo)

Francesca 16/03/2010 at 8:34 am

Dagli ultimi commenti di Giorgio desumo che, quindi, era parzialmente corretta la precedente versione..ci riprovo.

Quanto al fatto che il test del DNA in alcuni ordinamenti abbia una valenza solo negativa (serva solo per escludere che il reperto biologico appartenga ad un determinato soggetto), no, onestamente, non lo sapevo e mi stupisce. è vero che, se viene accertata una corrispondenza, bisogna andare a vedere la probabilità che quella corrispondenza sia casuale prima di poter trarre qualsiasi conclusione sulla fonte, ma, una volta che si conoscano questi due dati, mi sembra difficile che l’esito del test non possa quantomeno fungere da indizio – nell’ordinamento italiano la cassazione ha, invece, stabilito che ha valore di prova, e non di mero indizio, sia in positivo che in negativo. Inoltre, a quanto mi risulta, ed anche se i periti normalmente tendono a negarlo, il test può avere sia dei falsi negativi (ossia può escludere una corrispondenza che invece esiste), soprattutto se il reperto è misto, contaminato, parziale, ecc., sia del falsi positivi – sotto questo profilo, non fa molta differenza che sia usato per incolpare o per scagionare.

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